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原核表達(dá)系統(tǒng)案例展示

發(fā)表時(shí)間:2022-01-22 訪問次數(shù):2137

一、需求分析

  客戶需求:可提供蛋白序列,希望得到純度85%左右的500μg蛋白,蛋白后續(xù)用于酶活實(shí)驗(yàn),項(xiàng)目預(yù)算有限,后期可能需要大量蛋白。

  需求分析

  如項(xiàng)目預(yù)算有限,建議優(yōu)先選擇原核表達(dá)系統(tǒng),成本較為低廉,如后續(xù)需要進(jìn)行大體積放大,可直接進(jìn)行發(fā)酵,工藝成本更低;對于酶的表達(dá),普健的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在已往項(xiàng)目中有較為積極的客戶反饋; 基于以上分析,普健建議該項(xiàng)目選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。

二、蛋白性質(zhì)分析

  將蛋白序列在蛋白數(shù)據(jù)庫Uniport中比對,一致性較高為80.9%,用生物信息學(xué)工具進(jìn)行蛋白性質(zhì)分析。

  跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測:

原核表達(dá)系統(tǒng)

 

  信號肽預(yù)測:

原核表達(dá)系統(tǒng)

 

  疏水性預(yù)測:

原核表達(dá)系統(tǒng)

 

    蛋白性質(zhì)總結(jié):客戶提供蛋白序列一共234 AAs,蛋白大小為25.39 KDa,pI為8.80,疏水性一般,無跨膜結(jié) 構(gòu)域,無信號肽,無糖基化及二硫鍵修飾。

三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

  綜合蛋白性質(zhì)及客戶需求分析,設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)方案如下:選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)目的蛋白全長,N端融合6*His標(biāo)簽,表達(dá)載體為pET28b,選用BL21(DE3)、T7E為表達(dá)菌株,設(shè)置多個(gè)誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間,根據(jù)表達(dá)測試結(jié)果,選擇最優(yōu)條件進(jìn)行200mL放大,收集樣品采用Ni柱純化,交付蛋白樣品。

四、實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

  1、表達(dá)載體構(gòu)建

  利用生物信息學(xué)工具對目的蛋白全長片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化,降低稀有密碼子水平,用化學(xué)合成方法獲得目的蛋白基因序列片段,將片段亞克隆到pET28b表達(dá)載體,進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及測序確認(rèn)。進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及測序確認(rèn)。

  測序結(jié)果:

原核表達(dá)系統(tǒng)

 

  雙酶切驗(yàn)證結(jié)果:

 

      結(jié)果分析:NdeI/XhoI雙酶切測試結(jié)果顯示片段大小正確,測序結(jié)果顯示序列一致,確認(rèn)蛋白表達(dá)載體構(gòu)建成功。

  2、表達(dá)測試

  將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株、T7E菌株,挑取陽性克隆轉(zhuǎn)移到含Kana抗性的LB培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)3-4h,加入1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá),一組37℃培養(yǎng)4h,另一組16℃培養(yǎng)16h過夜,收集蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

  SDS-PAGE結(jié)果:

 

  結(jié)果分析:根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果,蛋白大小在25KD左右,與預(yù)測蛋白大小相符,比較各條件下蛋白表達(dá)情況,確認(rèn)該蛋白最優(yōu)的表達(dá)條件如下:

菌株 溫度 誘導(dǎo)時(shí)間
T7E 菌株 37℃ 4h

  3、放大純化

  按照得到的最優(yōu)表達(dá)條件,轉(zhuǎn)化200mL大腸桿菌,37℃培養(yǎng)3-4h,1mM IPTG誘導(dǎo)后,37℃培養(yǎng)4h,收集蛋白樣品,用Ni柱進(jìn)行蛋白純化,得到最終蛋白樣品。

  4、QC檢測

  將最終得到的蛋白樣品進(jìn)行濃度測定、SDS-PAGE檢測及His標(biāo)簽抗體的WB檢測。

  SDS-PAGE檢測及WB檢測結(jié)果:

                

 

結(jié)果分析:SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白大小在25KD左右,且蛋白純度較好,約為95%; His標(biāo)簽抗體的WB檢測結(jié)果顯示25KD左右曝出條帶,與目的蛋白預(yù)測大小相符。

五、交付材料

序號 樣品 濃度 分裝 緩沖液 管數(shù)
1 蛋白 1.00mg/ml 1.50ml/管 PBS pH7.5 2管
2 表達(dá)載體 100ng/ul  15ul/管 TE 1管
3 表達(dá)菌株 /  1.00ml/管 / 1管
合計(jì)管數(shù): 4管

六、項(xiàng)目結(jié)題

  從基因合成到交付蛋白樣品,項(xiàng)目為期5周,得到3.00mg目的蛋白樣品,由于酶活測試的多樣性與特殊性,交付給客戶進(jìn)行驗(yàn)收及酶活測試,客戶驗(yàn)證蛋白大小純度均與QC結(jié)果一致,酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛋白有生物活性,綜上,項(xiàng)目順利結(jié)題。

 

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